22 Olay örgüsüyle ilgili fazla şey bilinmezken oyununcunun, Ezio Auditore da Firenze adında genç, sonradan suikastçi olmuş bir asilzadenin rolünü yapacağı doğrulandı. Oyunun yaratıcı yönetmeni Patrice Desilets ile yapılan bir röportajda oyunun ana karakteri Ezio'nun ailesinin aile dostlarından biri tarafından öldürüldüğünu ve Ezio'nun, ailesinin intikamını almak için mücadele edeceğini açıkladı. Tıpkı birinci oyundaki Altaïr gibi, Ezio, Abstergo tarafından kaçırılmış bir barmen olan Desmond Miles'ın atalarından biri. Aynı zamanda Ezio, Üçüncü Haçlı Seferi döneminde Kutsal Topraklar'da yaşayan Altaïr'in torunlarından biri.

Atası Altaïr'den farklı olarak iki tane gizli bıçağı ve ekleme olarak sol gizli bıçağında ateşli bir silah ve bir de zehirli şırınga var. Oyunun 1486 yılında Rönesans İtalyası'nda geçmesi planlanıyor. Bu, ilk oyundan 295 yıl sonrasına denk geliyor. Assassin's Creed'deki gibi karakterler Leonardo da Vinci, Niccolò Machiavelli, Caterina Sforza, Lorenzo de' Medici gibi tarihi kişiler üzerine kurulu. Altaïr'den farklı olarak Ezio, gizli bıçağı için parmaklarını kesmemiş. Dostu Leonardo da Vinci bu bıçakları biraz geliştirerek parmaklarının kesilmesini önlemiş ayrıca bıçağa oyun boyunca 2 eklenti yapmış. Poison(zehir) bir de pistol eklemiş.

Oyun Venedik, Floransa , Roma ve Toskana çevresinde geçiyor. Ayrıca oyunda San Marco Basilikası, Büyük Kanal ve Rialto Köprüsü gibi yerler de olacak