Assasin's Creed Brotherhood tam Assasin's Creed 2'nin bittiği yerden başlıyor. Ezio ile Roma'dan Assasins Creed 2 Oyunundaki evimiz olan Montrigonni şehrine dönüyoruz. Herşey yolunda giderken aniden gelen bir işgal saldırısı ile aksiyonun içine balıklama dalıyoruz. Savaşta Mario Auditore'nin ölümü ve bizim ağır yaralanmamızdan sonra kendimizi tekrar Roma şehrinde buluyoruz. Ezio bu sefer hem intikam almak için, hem de tapınakçıların çok büyük bir gücü olan Apple Of Eden'ı (Cennetin Elması) kullanmalarını engellemek için savaşması gerekecektir.

Desmond Miles'ın senaryosu ise gittikçe ilginç hal almaya başlayacak. Desmond artık İnsanlardan Önce Gelenler (Those who came before) ırkının yaptığı tapınaklara gitmek ve Abstergo Industries'in yaptığı kanlı planı durdurabilmesi için Piece Of Eden'i edinmek ve onu Abstergo Endüstrilerine karşı nasıl kullanabileceğini öğrenmek zorunda.